DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
Como para otras enfermedades infecciosas la identificación de la enfermedad en el laboratorio se puede establecer mediante la detección del virus o de sus restos moleculares, así como mediante la detección de los anticuerpos específicos.

Antes de analizar las diferentes técnicas utilizadas para el diagnóstico laboratorial conviene recordar qué tipo de muestra son necesarias y cómo deben ser tomadas y remitidas al laboratorio.

Toma y envío de muestras:

Para establecer un diagnóstico correcto de la enfermedad es necesario enviar al Laboratorio de Referencia las muestras en condiciones adecuadas para permitir la conservación del virus.

En el caso de la FA las muestras de elección son las siguientes:
- Vesículas: epitelio de aftas y líquido de vesículas de los animales sospechosos
- Sangre
- Suero
- Saliva
- Hisopos faríngeos y nasales
- Fluido esofaríngeo (probang cups)
- Tejidos
- Leche

Estas muestras han de ser recogidas de forma estéril y debe tenerse mucha precaución para que las mismas no entren en contacto con ningún desinfectante que pudiera producir una inactivación viral. El virus también se puede inactivar debido a modificaciones del pH, por lo que las muestras de epitelios, saliva y líquido vesicular se deberán remitir incluidas en un medio de transporte con capacidad tampón que garantice la estabilidad del pH entre 7,2 y 7,6.

  Debido al riesgo biológico que supone el manejo de estas muestras, el envío de las mismas al laboratorio deberá realizarse en adecuadas condiciones de bioseguridad.

Extracción del liquido de la vesícula aftosa. Este material presenta un gran numero de partículas virales.


Técnicas para la detección e identificación del virus/antígeno:

Aislamiento Viral

Suspensiones de muestras de campo sospechosas de contener VFA deben ser clarificadas e inoculadas en cultivos celulares. Se pueden utilizar líneas celulares establecidas como BHK-21 e IBRS-2, o cultivos primarios de células de tiroides bovino, muy sensibles al VFA, donde el virus produce un efecto citopático (ECP) en las células infectadas. Los sobrenadantes obtenidos de los cultivos que muestren ECP se deberán examinar posteriormente mediante ELISA de captura de Antígeno para confirmar la presencia del VFA en las muestras y determinar el serotipo.

 

Esquema del ELISA Sandwich Indirecto.
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Es importante destacar que el material enviado al laboratorio para la realización del diagnóstico ha de ser de gran calidad y debe haber sido enviado en condiciones óptimas de conservación, especialmente en cuanto al mantenimiento de un adecuado pH y temperatura, porque muchas veces el resultado negativo puede ser debido a una mala calidad de las muestras y no a una ausencia del virus en el animal.

Identificación del virus

Para la identificación se emplean técnicas de fijación de complemento (FC) o ELISA de captura de antígeno. La FC es una técnica que actualmente ha sido sustituida en la mayoría de los laboratorios por el ELISA de antígeno, que es más rápido, fácil de realizar, más especifico, más sensible y permite el análisis de un mayor numero de muestras.

Los ELISAs utilizados son de tipo sandwich indirecto frente a diferentes serotipos de FA, que poseen una sensibilidad limitada y detectan a partir de títulos superiores a 104 DITC50/ml.


Detección del ácido nucleico viral

Las técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) permiten la detección del RNA del virus mediante la amplificación de fragmentos específicos de genoma del VFA en muestras de fluidos vesiculares, epitelios de aftas, saliva, hisopos, suero o sangre completa (con EDTA), procedentes de animales infectados. Este método presenta una sensibilidad y especificidad muy elevada, pudiendo realizar un diagnóstico positivo en muestras de sangre completa obtenidas a partir del 2º día de la infección del animal, si bien el periodo de viremia resulta muy corto, durando un máximo de 3 a 5 días.


Esquema de un ciclo de PCR.
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Secuencia de amplificación de ADN durante la PCR.
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Esquema de PCR múltiplex para dos virus diferentes.
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  Mediante estas técnicas moleculares, y concretamente mediante la RT-PCR, es posible identificar específicamente el serotipo utilizando oligonucleótidos seleccionados de regiones muy variables correspondientes a la proteína estructural VP1.También se dispone de una técnica de PCR múltiplex que permite la diferenciación específica mediante un único ensayo de las tres principales enfermedades vesiculares: Fiebre Aftosa, Enfermedad Vesicular del Cerdo y Estomatitis Vesicular.

Los cebadores empleados en la PCR pueden ser generales de VFA, con los cuales podremos detectar todos los serotipos de VFA, o específicos de serotipo, con los que se detectarán exclusivamente los virus de un serotipo determinado. El producto amplificado mediante esta técnica se puede secuenciar con objeto de realizar estudios de epidemiología molecular que nos permitan determinar el origen de un virus mediante la elaboración del correspondiente árbol filogenético.

 

Árbol filogenético del virus inductor del brote de Fiebre aftosa del reino Unido del año 2001.
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Métodos para la detección de anticuerpos

Las técnicas más utilizadas en la actualidad para la detección de anticuerpos específicos de FA son: la Veroneutralización (VN) y el ELISA sandwich de bloqueo en fase líquida.

La VN es una técnica sensible, específica, cuantitativa y que permite la identificación especifica de serotipo. Es la técnica de referencia y está recomendada para la confirmación de sueros positivos o dudosos a ELISA, pues por su laboriosidad y necesidad de utilización de cultivos celulares no permite el estudio sobre un número elevado de muestras. Otros dos inconvenientes añadidos son la necesidad de un mínimo de 2-3 días para la realización de esta técnica, lo que retrasa el diagnóstico, y la necesidad de emplear virus vivo de FA, lo que implica la necesidad de emplear laboratorios con niveles de bioseguridad elevado debido al riesgo de escape de virus.


El ELISA de bloqueo en fase líquida (ELISA-LPB) es una técnica sensible, específica, cuantitativa y que permite también la identificación del serotipo. Es la técnica de elección para el estudio de un gran número de muestras. Otras ventajas frente a la VN son su rapidez para obtener un diagnóstico serológico (tan sólo unas horas), su reproducibilidad y su independencia del empleo de cultivos celulares. Detecta animales positivos a partir del 4º día post-infección, si bien, al igual que en la VN, se deben emplear reactivos específicos para cada serotipo, por lo que en realidad se deberían realizar 7 ELISAs para garantizar un resultado negativo (frente a los serotipos A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 y Asia1). Este ELISA detecta tanto anticuerpos frente a proteínas estructurales como no estructurales, por lo que tanto los animales infectados como los vacunados frente al VFA resultarán positivos sin poderse diferenciar.

 

Esquema de ELISA de Bloqueo en Fase Líquida para detección de anticuerpos frente a proteínas estructurales y no estructurales del VFA.
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Esquema del ELISA 3ABC para la detección de anticuerpos frente a proteínas no estructurales del VFA.

  Nuestro laboratorio (CISA-INIA) ha participado muy activamente en el desarrollo y puesta a punto de una técnica de ELISA indirecto que emplea como antígeno una proteína no estructural muy inmunogénica del VFA (3ABC recombinante producida en E. Coli), que permite la diferenciación eficaz entre animales vacunados e infectados, con un buen nivel de sensibilidad y especificidad. Este ELISA-3ABC es fácil de realizar, rápido, no necesita utilizar anticuerpos monoclonales y permite su uso para el análisis de sueros de distintas especies (ovejas, vacas, cerdos) simplemente cambiando el reactivo detector de la prueba (conjugado).

Igualmente, se han desarrollado en otros laboratorios diferentes ELISAs que permiten la detección de anticuerpos frente a proteínas no estructurales del VFA, unos utilizando la proteína 3ABC completa y otros utiliza péptidos sintéticos de las proteínas no estructurales.

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