| Capítulo 5. ¿Cómo se estudian las inmunoglobulinas? |
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| ¿Cómo se estudian las inmunoglobulinas? |
Las
inmunoglobulinas porcinas se encuentran en dos formas
diferentes: formando parte del receptor BcR de los
linfocitos B o como anticuerpos en el suero, fluidos
corporales y tejidos. Su estudio representa un arma
fundamental en Sanidad Animal.
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El control genético de la producción de inmunoglobulinas, resuelve
con elegancia y creatividad lo que podría
ser un grave problema.
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Esquema
de funcionamiento del citómetro de flujo para
la detección de inmunoglobulinas de superficie
en linfocitos B. Las células en suspensión
a los que se les han añadido los diferentes
AcM (anti IgA e IgG) pasan a través de un tubo
muy fino en una sóla fila de células,
y son leídas por el láser y el haz de
luz; el primero identifica los anticuerpos marcados
y el segundo, el tamaño de las células. |
NMUNOGLOBULINAS
DE SUPERFICIE
Como vimos
en el capítulo 2 ¿Cómo
se estudian los linfocitos B?, existen varios métodos
para estudiar las inmunoglobulinas de membrana de los
linfocitos B que forman el receptor BcR. Los dos
mas utilizadas son:
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Imagen
de una aglutinación en tubo
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Las
inmunoglobulinas libres en suero, calostro,
leche, fluidos, etc. pueden ser estudiadas como
inmunoglobulinas totales, sin considerar frente
a que antígeno reaccionan, o como anticuerpos
específicos frente a distintos antígenos
de interés. Para este último tipo
de estudios, que sin duda es el más interesante, se
disponen de un gran número de técnicas que
van desde las clásicas de precipitación,
fijación de complemento, etc; a las más
modernas y cada día mas utilizadas técnicas
inmunoenzimaticas. |
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| Sensibilidad
de las diferentes técnicas para
la detección de anticuerpos (mg/ml) |
| MÉTODO |
SENSIBILIDAD
(mg/ml) |
| Precipitación
en gel |
30 |
| Precipitación
en anillo |
18 |
| Aglutinación
bacteriana |
0,05 |
| Fijación
de complemento |
0,05 |
| Hemaglutinación
pasiva |
0,01 |
| Inhibición
de la hemaglutinación |
0,005 |
| Inmunofluorescencia |
0,005 |
| ELISA |
0,0005 |
| Neutralización
bacteriana |
0,00005 |
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Las
diferencias de sensibilidad, especificidad, capacidad
de utilización a gran escala, etc. son algunos
de los conceptos más importantes a la hora
de seleccionar una u otra técnica. Así, respecto
a la sensibilidad podemos observar que hay técnicas
con niveles bajos como las de precipitación,
de sensibilidad media como las aglutinación
bacteriana, fijación de complemento y
otras de sensibilidad mayor como el ELISA,
la seroneutralización o la actividad
bactericida.
El
desarrollo de la biología molecular y la producción
de anticuerpos
monoclonales, ha
permitido disponer, en los últimos años,
de reactivos de diagnóstico de gran sensibilidad
y especificidad, incluso en forma de KITS, de fácil
y sencilla realización e interpretación.
De entre todos los métodos actualmente disponibles,
destacaremos en este capítulo, por una parte, aquellos
que presentan las mayores posibilidades para llevar a cabo
estudios serológicos a gran escala y pueden ser
realizados sin necesidad de grandes medios técnicos.
Por otra parte,
repasaremos otros métodos que permiten estudiar
un número reducido de muestras, pero que presentan
buenos índices de sensibilidad, especificidad
y que no requieren gran equipamiento. Por último,
veremos una técnica de
referencia para todos los estudios serológicos,
que precisa de mayor infraestructura y tiempo de realización,
pero que debido a su importancia incluimos.
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Los
principales métodos que reúnen estas
características son:
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- INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
O WESTERBLOT
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- INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA O INMUNOPEROXIDASA
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ELISA
La técnica
inmunoenzimática ELISA forma parte de aquellas
reacciones serológicas que utilizan conjugados
para poder visualizar la reacción ANTIGENO-ANTICUERPO.
El ELISA, se basa en el uso de anticuerpos marcados con
una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que
los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica
como enzimática. Al estar uno de los componentes
(antígeno ó anticuerpo) insolubilizados
sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y por tanto, podrán
fácilmente ser revelada mediante la adición
del sustrato, que al actuar sobre la enzima, producirá un
color observable a simple vista o cuantificable mediante
un colorímetro.
Existen bastantes
KITS comerciales disponibles y por tanto pueden realizarse
estudios serológicos sin necesidad de grandes
medios.
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En
la primera línea se observa el suero control
positivo y en la segunda el negativo. Los sueros
problema por duplicado han sido colocados en
el resto de la placa, se observan positivos (azul)
y negativos (sin color).
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En la
actualidad el ELISA es uno de los métodos más
utilizados para el diagnóstico serológico
de distintas enfermedades infecciosas porcinas.
El método ELISA está recomendado fundamentalmente
para el estudio de poblaciones. Es
una técnica altamente sensible y de gran especificidad,
que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios
sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y económica.
Esta técnica presenta además una buena reproducibilidad
y facilidad en la interpretación de los resultados.
Se han adaptado varios tipos del método ELISA tanto para la determinación de ANTÍGENOS como de ANTICUERPOS:
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Fases
de la técnica Elisa Sandwich. (1) Un anticuerpo
monoclonal o policlonal anti antígeno
suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba
con la muestra problema. (3) se añade
el conjugado. (4) por último el sustrato.
Todos los pasos van precedidos de incubaciones
y lavados.
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DETERMINACIÓN
DE ANTÍGENOS
La modalidad
más frecuente del método ELISA para la
determinación de antígenos es el modelo
ELISA "Sandwich". En esta forma, la placa
suele ya venir con un anticuerpo fijado (monoclonal ó policlonal)
frente al antígeno problema, sobre el que se
añadirá el macerado del órgano
sospechoso, que en caso de reaccionar con el anticuerpo
de la placa, será puesto en evidencia tras la
adición del segundo anticuerpo marcado con la
enzima. Por último, se añade el
substrato para revelar la reacción. |
DETERMINACIÓN
DE ANTICUERPOS
Para la determinación
de anticuerpos específicos frente a un determinado
antígeno se utilizan normalmente las siguientes
modalidades del método ELISA:
-
ELISA
INDIRECTO.
- ELISA
COMPETICIÓN.
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Fase
de la técnica Elisa indirecto. (1) El
antígeno se pega a la placa (2) Se añade
el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado.
(4) y por último, el sustrato.
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ELISA
INDIRECTO
Es el método
más utilizado para la determinación de
anticuerpos. Básicamente, consiste en la inmovilización
a la placa de ELISA del antígeno (en los
Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en
el suero problema existen anticuerpos específicos.
Se pueden utilizar como antígenos, proteínas
virales o bacterianas e incluso virus completos.
Cada día es más frecuente utilizar exclusivamente
las proteínas de interés inmunológico
y no todas las proteínas antigénicas. Los
pasos siguientes serian la adición del suero problema,
incubación y lavado, adición del conjugado,
incubación y lavado, finalizando con la adición
del sustrato, el frenado de la reacción y la lectura.
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Fases de la Técnica Elisa de competición.
(1) Se incuba el suero problema con el antígeno.
(2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos
donde previamente se ha fijado un suero anti antígeno
(3) se añade el conjugado. (4) después, el
sustrato. En este caso la ausencia de color sería
positivo.
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ELISA
DE COMPETICIÓN
En este sistema
también es muy utilizado para la detección
de anticuerpos específicos. Se parte de un anticuerpo
(monoclonal o policlonal), frente a un antígeno
conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la
placa. Se denomina de competición ya que el
suero problema es incubado previamente con el antígeno,
antes de incubarlo con el antisuero fijado en la placa,
y por tanto compite con él.
Los pasos
siguientes es la adición e incubación del
conjugado, lavado y finalización con el sustrato y
lectura.
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foto Kit ELISA 1
Material
necesario para la realización de la
técnica de ELISA..
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INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
O WESTERBLOT
La inmunoelectrotransferencia "westerblot" o "Immunoblotting" es
una técnica inmunoenzimática que se utiliza
para la detección de anticuerpos especificos. Se
recomienda cuando no hay que estudiar un gran número
de sueros o para analizar sueros dudosos por otras
técnicas. Este método utiliza
como soporte antigénico filtros de nitrocelulosa,
donde las proteínas del antígeno han
sido previamente transferidas, manteniendo total o
parcialmente sus propiedades antigénicas.
Para la obtención
de los filtros antigenados, las proteínas son
separadas previamente mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferidas a continuación,
mediante corriente eléctrica, al filtro de nitrocelulosa.
Este filtro es recortado en pequeñas tiras, que
constituirán el soporte de tiras antigenadas.
Sobre cada una de ellas se incubara el suero problema
y los sueros control positivo y negativo. Tras un periodo
de incubación y posterior lavado se agrega un
conjugado anti inmunoglobulina G o M (según cual
de ella se desee estudiar). Si hay inmunoglobulinas unidas
a las proteínas antigénicas serán
reveladas por el conjugado. Se podrá observar
una o varias líneas de precipitación especificas
según existan anticuerpos frente a una o varias
proteínas. La especificidad se demuestra al reaccionar
con las proteínas cuyo peso molecular coincida
con las proteínas antigénicas.
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Fase
final de la técnica. Se pueden observar
la aparición de las diferentes bandas
con las que ha reaccionado el suero problema
y los sueros control.
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Es
una técnica muy sensible, de fácil manejo,
ejecución e interpretación. No necesita
de equipos especial para su realización.
Esta técnica
está fundamentalmente indicada en el estudio
de un número no muy elevado de sueros. Al
no necesitar ningún tipo de equipo especial,
es de fácil realización incluso con pocas
condiciones laboratoriales. En la actualidad existen
varios Kits disponibles para distintas enfermedades,
siendo cada día la oferta mayor.
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Técnica
de inmunofluorescencia indirecta. Células
MS infectadas con el virus de la Peste porcina
africana. Se puede observar como los anticuerpos
se han unido a la células infectadas,
destacándose en el citoplasma unas zonas
con una intensidad mayor, que corresponden
a zonas de mayor replicación viral,
y por tanto mayor fijación de anticuerpos.
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LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA O INMUNOPEROXIDASA
La inmunofluorescencia
indirecta o la inmunoperoxidasa, según se utilice
el isocianato de fluoresceína o la peroxidasa, son
técnicas que utilizan la especificidad de la histología
(pueden ver la célula y comprobar que la reacción
inmunológica se produce en un sitio especifico)
con la sensibilidad de las técnicas inmunológicas.
Estas técnicas utilizan
normalmente cultivos celulares (primarios o de líneas
estables) infectados con el virus o la bacteria sobre la
que se desea comprobar si hay o no anticuerpos en el suero
problema. Tras la incubación con el suero problema;
si hay anticuerpos se unirán a las células
infectadas pero no a las no infectadas (especificidad histológica
observable). La unión se visualiza tras la adición
de un conjugado anti-inmunoglobulina marcado con isocianato
o con peroxidasa y la posterior observación al microscopio
de fluorescencia o convencional respectivamente.
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Tapiz
celular infectado.
Fases
de
la
Técnica
Elisa
de
competición.
(1)
Se
incuba
el
suero
problema
con
el
antígeno.
(2)
La
mezcla
anterior
se
deposita
sobre
los
pocillos
donde
previamente
se
ha
fijado
un
suero
anti
antígeno
(3)
se
añade
el
conjugado.
(4)
después, el
sustrato.
En
este
caso
la
ausencia
de
color
sería
positivo.
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SERONEUTRALIZACIÓN
Este método
está considerado de referencia para cualquier
estudio serológico pues es el que más
se correlaciona entre la respuesta "in vitro" y
la respuesta "in vivo". En esta prueba
se puede valorar la capacidad que tienen los anticuerpos
presentes en un suero problema para neutralizar la
actividad biológica de un antígeno.
Los métodos
descritos hasta ahora permiten valorar la capacidad
que un suero determinado tiene para reconocer un antígeno
concreto, en la seroneutralización se avanza
un paso más y se indica la capacidad que tiene
un suero para neutralizar la actividad biológica
del antígeno. Estos métodos son ampliamente
utilizados en los laboratorios para valorar la capacidad
de un suero frente a toxinas bacterianas, bacteria y/o
virus. Estas pruebas son más laboriosas, requieren
de cultivos celulares, esterilidad, además de
ser generalmente más lentas que todas las anteriores.
Sin embargo son altamente especificas y sensibles, y
se consideran las pruebas de referencia para cualquier
valoración serológica.
En el caso
de los virus, se puede medir la capacidad que un determinado
suero tiene para neutralizar la infectividad del virus
sobre una línea celular sensible. Se añade
una mezcla de virus a una concentración constante
que previamente ha estado en contacto con diferentes
diluciones del suero problema sobre las células.
Se van observando las células sobre la que se
han añadidos las distintas diluciones para ver
si el virus las ha infectado o no mediante la tinción
con un conjugado o por el efecto citopático. De
esta forma se puede medir la capacidad de neutralización
viral de un suero problema.
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